一．非变性条件下抽提His Tag 蛋白质
下列方法适用于从细菌中抽提通常含有连续6个组氨酸尾（His-6）的具有天然结构的可溶性重组蛋白质。其他来源的蛋白质样品，如果目标蛋白质具有His-6结构，提供的层析方法可供参考。
Ni2+亲和柱的制备
1． 轻轻颠倒混匀固化Ni2+树脂，取2ml装入层析柱，树脂自然沉降。
2． 用3倍柱体积的无菌水冲洗树脂。（树脂自然沉降后为1个柱体积）
3． 用3倍柱体积的结合缓冲液（pH7.8）平衡树脂，放置待第9步使用。
制备细胞抽提物
4． 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600＝0.5-0.8时，用1mmol/LIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率，收集细胞。每100ml细胞培养物的细胞沉淀，悬于4ml结合缓冲液（pH7.8）.
5． 加入溶菌酶至终浓度１mg/ml,（如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶）冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞（冰上操作）。
6． 混合物于4℃摇床上孵育10min。
7． 加入Triton X-100 、DNase和RNase,终浓度分别为１％、5ug/ml和5ug/ml,再于４℃摇床上孵育10min。
8． 4℃20000g(15000r/min Sorvall SS-34转头)离心30min,去掉不溶性细胞碎片，上清（细胞裂解液）转移到另一个新管中。
纯化带组氨酸标签蛋白
９．树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10．步骤8获得的上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积（15-20 ml/小时）。
11．用6个柱体积的结合缓冲液（pH7.8）洗柱。
12．用4个柱体积的洗涤缓冲液（pH7.8）洗柱，直到流过液A280＜0.01。
13．用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱液洗脱结合的蛋白，每份1ml分步收集，监测A280。
14．用咪唑浓度更高（50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L）的洗脱液重复步骤13。
15．用20ul等份的蛋白进行SDS-PAGE，分析蛋白分布。
试剂配方
1．结合缓冲液：（pH7.8）
20mmol/L磷酸盐缓冲液
500mmol/L氯化钠
2．洗涤缓冲液：（pH7.8）
20mmol/L磷酸盐缓冲液
500mmol/L氯化钠
10mmol/L咪唑
3．咪唑洗脱缓冲液：（pH7.8）
20mmol/L磷酸盐缓冲液
500mmol/L氯化钠
在上面缓冲液体系中加入咪唑分别配成50mmol/L、100mmol/L和150mmol/L的咪唑洗脱缓冲液。
 
二．变性条件下从包涵体中纯化His Tag的蛋白质
  有些蛋白质细菌或其他细胞中表达效率很高，但溶解性很差，通常形成包涵体。这些蛋白质的溶解通常需要用盐酸胍或尿素。与MBP和GST的亲和层析相比，NTA树脂可以在6M盐酸胍存在下与具有His Tag的蛋白质结合。整个过程都是在有盐酸胍的条件下进行。纯化后的蛋白质需要复性，正确复性的蛋白质才具有生物学活性.下列方法用于从细菌中抽提含HisTag位于包涵体变性蛋白质。
Ni2+亲和柱的制备
1．轻轻颠倒混匀固化Ni2+树脂，取2ml装入层析柱，树脂自然沉降。
2．用3倍柱体积的无菌水冲洗树脂。（树脂自然沉降后为1个柱体积）
3．用3倍柱体积的NTA-0 Buffer平衡树脂，放置待第9步使用。
制备细胞抽提物
4． 准备细胞，接种，诱导表达。对于实验室用的pET载体表达系列，在细胞OD600＝0.5-0.8时，用1mmol/LIPTG诱导1-3小时，可以获得理想的表达效率，收集细胞。加入溶菌酶至终浓度１mg/ml,（如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加溶菌酶）冰上放置30min，超声或匀浆破碎细胞（冰上操作）。
5． 加入1/20细胞生长体积的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF用无水乙醇配制成200mM储存液，-20℃或4℃保存，PMSF的使用浓度为1mM ,注意：PMSF见水分解，需要在使用前加入。
6． 将细胞悬起来，冰上超声破碎细胞，降低粘稠度。
7． 室温放置30分钟，间或混匀或用磁力搅拌。
8． 15000转/分（20000g以上），4℃离心30分钟，取上清，置于冰上备用或-20℃保存。
层析
９．树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部。
10．步骤8获得的上清上柱，流速调整为每小时10个柱体积（15-20 ml/小时），收集穿柱部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。
11．用6个柱体积的NTA-0 Buffer（pH7.8）洗柱。
12．用4个柱体积的NTA-10 Buffer（pH7.8）洗柱，直到流过液A280＜0.01。
13．分别用5个柱体积的NTA-40 Buffer、NTA-60 Buffer、NTA-80 Buffer、NTA-100 Buffer、NTA-250 Buffer洗脱结合的蛋白，每份1ml分步收集，监测A280。
14．确定目标蛋白质在洗脱液中的分布情况，最有效的方法是用SDS-PAGE分析。
15．目标蛋白质需要进一步纯化需要根据目标蛋白质的用途而定
16．纯化的目标蛋白质需要复性，复性的手段可以参考有关方案。
试剂配方
NTA-0 Buffer：
   20mM Tris-HCl pH7.8 , 0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl
NTA-10 Buffer：
   20mM Tris-HCl pH7.8 , 0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  10mM Imidazole
NTA-40 Buffer：
   20mM Tris-HCl pH7.8 , 0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  40mM Imidazole
NTA-60 Buffer：
   20mM Tris-HCl pH7.8 , 0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  60mM Imidazole
NTA-80 Buffer：
   20mM Tris-HCl  pH7.8 ,0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  80 mM Imidazole
NTA-100 Buffer：
   20mM Tris-HCl  pH7.8 ,0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  100 mM Imidazole
NTA-250 Buffer：
   20mM Tris-HCl  pH7.8 ,0.5M NaCl ,10%Glycerol,6M Guanidium HCl  250 mM Imidazole
 
 
Ni-NTA  Sepharose4B的再生方案
 
NTA树脂在使用若干次（3-5次）后，结合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高树脂的使用寿命和蛋白质的结合效率，经过充分洗涤并再生，NTA树脂几乎可以无限制使用，如果层析柱没有氧化或耗竭（亮蓝色消失或出现黄、褐颜色）。
  NTA再生步骤：
1 从层析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA树脂体积的stripping Solution I洗。
2 用5倍体积的去离子水洗。
3 用2倍体积的stripping Solution II洗。
4 用1倍体积的25%乙醇洗。
5 用1倍体积的50%乙醇洗。
6 用1倍体积的75%乙醇洗。
7 用5倍体积的100%乙醇洗。
8 用1倍体积的75%乙醇洗。
9 用1倍体积的50%乙醇洗。
10 用1倍体积的25%乙醇洗。
11 用1倍体积的去离子水洗。
12 用5倍体积的stripping Solution III洗。
13 用1倍体积的去离子水洗。
14 用小于2倍体积的Ni Charging Solution洗，用水洗，用适当的平衡缓冲液平衡。（EDTA冲洗或EDTA洗蛋白后的树脂应呈白色，再生后应变回淡蓝色）。
15 如果想长期储存，加入1倍体积的20%乙醇，4℃保存，使用前需要执行步骤14。
 
试剂配制：
Stripping Solution I：0.2M乙酸/6M 盐酸胍
Stripping Solution II：2%SDS
Stripping Solution III：0.1M EDTA pH8.0
Ni Charging Solution：100mM NiSO4